میکروبیولوژی

زیست سلولی

موضوع : گزارش کار آزمایشگاه زیست سلولی

 

استاد مربوطه : دکتر ملکی


تهیه کنندگان : سجاد رشیدی 


رشته ی تحصیلی : میکروبیولوژی

 

سال تحصیلی : نیم سال دوم تحصیلی 90-89

موضوع جلسات :

 

1- تهیه ی اسمیر خون و مشاهده ی سلول های خونی

 

2- نحوه ی شمارش سلول

 

3- شمارش سلول خونی

 

4- تهیه ی عصاره ی DNA از بافت گیاهی

 

5- تهیه ی اسلاید یا لام تقسیم میتوز از ریشه ی گیاهی

 

6- مطالعه ی لام آماده ی بیضه ی موش برای تقسیم میوز

 

7- جداسازی و کشت سلول

جلسه ی اول :

تهیه ی اسمیر خون و مشاهده ی سلول های خونی

 

روش کار : برای تهیه ی اسمیر خون blood smear با پنبه ی الکلی نوک انگشت را تمیز می کنیم . سپس با lancet سوراخی در آن ایجاد می کنیم و یک قطره خون را بر روی لام در یک لبه قرار می دهیم .لام دیگر با زاویه ی 30 تا 40 درجه را به قطره ی خون نزدیک می کنیم و سپس وقتی قطره ی خون به لام چسبید با یک سرعت مناسب و پیوسته به سمت چپ می کشیم . در مرحله ی بعد اسمیر را خشک می کنیم و مرحله ی دوم را اجرا می کنیم.

lancet

Fixation : برای عمل Fix کردن از متانول یا اتانول 95% استفاده می کنیم.این عمل 3 تا 5 دقیقه طول می کشد . در مرحله ی بعد الکل را خشک می کنیم و بر روی نمونه رنگ Giemsa می ریزیم که مخلوطی از eosim + متیل بلو است . بین 16 تا 30 دقیقه صبر می کنیم.می توانیم این کار را تا 4 بار تکرار می کنیم و سپس لام را زیر آب گرفته و یا با آب مقطر می شوییم و سپس با میکروسکوپ نوری انواع سلول را مشاهده می کنیم.

سلول هایی که مشاهده خواهیم کرد :

1- ایریتروسایت ها یا گلبول ها ی قرمز : به قطر 6.5 تا 7.5 میکرومتر به صورت صفحات مقعر الطرفین دیده می شود و فراوان ترین سلول است و بعضی از آنها ممکن است به نام ماکروسایت به قطر 9 میکروسایت به قطر 6 میکرو متر دیده می شود.                         

2- پلاکت ها یا ترمبوسایت :این ها سلول های واقعی خون حساب نمی شوند بلکه قطعاتی از یک سلول بزرگ به نام مگاکاریوسایت هستند با قطر تقریبا 3 میکرومتر به رنگ ارغوانی در کنار گلبول های خون دیده می شوند.

3- گلبول های سفید :

1-3 : اگرانولوسیت ها : این ها دارای یک هسته و سیتوپلاسم شفاف هستند که عبارتند از:

1- لنفوسیت ها : تقریبا 20 تا 40 درصد سلول های خونی را به خود اختصاص می دهند که دارای یک هسته ی گرد و بزرگ بوده و سیتوپلاسم کمی بصورت شفاف در یک سمت سلول دیده می شود.اندازه ی بین 10-8 میکرومتر را دارند.

لنفوسیت

2- مونوسیت ها : با قطر 20 تا 16 میکرومتر و درشت ترین گلبول های سفید هستند که دارای یک هسته ی لوبیایی شکل و نعل اسبی شکل و سینوپلاسم شفاف می باشند.

مونوسیت

 

2-3 : گرانوسیت ها :

1- نوتروفیل ها : با قطر 12 تا 15 میکرومتر فراوان ترین گلبول های سفید هستند.هسته ی آنها دارای 2 تا 5 لب است و گرانول های کم رنگی دارند و خیلی کوچک اند.بر روی هسته ی این سلول ها زایده ای دیده می شود که به آن بار بادی گفته می شود که همان یکی از کروموزوم های X غیر فعال شده است.

نوتروفیل

 

 

2-ائوزینوفیل ها : به تعداد 1 تا 3 درصد در خون دیده می شوند و معمولا هسته ی آنها دارای دو لبه است که البته ممکن است 3 تا 4 لبه دیده شود.در سیتوپلاسم آنها گرانول های نارنجی و صورتی دیده می شود ولی هسته توسط گرانول ها پوشانیده نشده اند.

ائوزینوفیل

 

3- بازوفیل ها : کمتر از 1 درصد سلول های خونی را به خود اختصاص می دهد.10-9 میکرومتر قطر دارد.غنی از گرانول های ارغوانی تیره است که سطح هسته را می پوشانند.

بازوفیل

 

 

جلسه ی دوم :

شمارش سلولی

(CELL COUNTING)

روش کار : از لام نئوبار neubauer برای شمارش سلول استفاده می کنیم . این لام یک لام معمولی است که روی آن یک لامل مخصوص دیده می شود.بین لام و لامل فاصله ای به اندازه ی 0.1 است .

                                                                             لامل

 


لام نئوبار

                                                                                             لام

 

 

Mm30.1=0.1×1×1=حجم مربع های بزرگ

3(mm10)×1= 3cm1=cc1=ml1

3mm103=ml1

3m103   ml1

3mm0.1  ml4- 10                        حجم مربع بزرگ

برای شمارش گلبول های سفید خون و نیز سلول های کشت داده شده در آزمایشگاه از چهار مربع بزرگ در گوشه های هم استفاده می کنیم.

نکته : برای شمارش از عدسی 10× استفاده می کنیم.

برای اینکه ببینیم در کشت سلولی ما سلول ها زنده هستند یا نه از محلول تریپان بلو استفاده  می کنیم.سلول های مرده توسط این رنگ به رنگ آبی در می آیند ولی سلول های زنده روشن و یک حلقه ی روشن در اطرافش دیده می شود.

قانون شمارش : سلول هایی که روی اضلاع راست و پایین قرار دارند را نمی شماریم.

مثال:

اگر 5 میلی لیتر سوسپانسیون سلولی داشته باشیم و نیز 10 میکرومتر برداریم و به اضافه ی 10 میکرومتر تریپان بلو به آن اضافه کنیم و در داخل میکروتیوپ بریزیم (به یک نسبت باید باشد ) (این محلول بدست آمده 20 برابر رقیق تر شده چون نصفش را تریپان بلو اضافه کردیم):

برای مثال شمردیم شد 30 تا سلول در 16 تا مربع یا ml4- 10

Ml         4- 10    cell 30                                                                                                                                                                                                                                              

Ml                           1     cell104×30=  x

پس 90% سلول ها زنده اند

 =درصد سلول های زنده

104 ×فاکتور رقعت × تعداد سلول ها در مربع بزرگ = تعداد سلول ها در هر میلی لیتر

/ml cell 104 × 2 × 30 =

6- 10 × 3 = کل سلول

106  × 2.7 = 90% زنده

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

جلسه ی سوم :

شمارش سلول های خونی

روش کار : لام را با الکل تمیز می کنیم و یک قطره خون ( اولین قطره را دور می ریزیم ) و برمیداریم که حدودا 10 میلی لیتر باید برداریم .سپس در لوله ی آزمایش می ریزیم و حدود cc2 Hayems ( لیز کننده ی گلبول سفید ) را با سرنگ در لوله ی آزمایش می ریزیم و بعد پیپت کرده و سوسپانسیون درست می کنیم.می خاهیم تعداد سلول ها را در mm3/cell پیدا کنیم.

0.1Mm3/تعداد سلول ها                        D = 5 × A

تعداد سلول = 200× B

حال پنج خانه از لام را شمرده و عدد های مربوطه را جاگذاری می کنیم

 

107

81

84

88

91

 

 

 


و بعد عددهای بدست آمده را با هم جمع می کنیم

451 = 88 + 84 + 81 + 91 + 107

2675= 5 × 451

2675        m3 0.1

26750B=     mm3 1 

104 × 535 = 200 × B

جلسه ی چهارم :

مطالعه ی لام آماده بیضه ی موش برای تقسیم میوز

مهم : تقسیم میوز : یک سلول کاهشی است

پروفاز ɪ :

مرحله ی اول Leptotene stage

مرحله ی دوم Zygotene

مرحله ی سوم Pachytene

مرحله ی چهارم Diplotene

مرحله ی پنجم Diakinesis

در مرحله ی دوم کروموزوم ها جفت می شوند و در باکی تن به طور ضخیم و فشرده می شوند.

این تقسیم در تخم دان ها و بیضه صورت می گیرد.

به سلول های اجدادی اسپرم ،اسپرماتوگونیوم گویند و نیز به اسپرمی که از اسپرماتوگونیوم وارد مرحله ی میوز ɪ (پروفاز ɪ ) می شود اسپرماتوسیت اولی گویند که هسته ی درشت دارند و دارای کروماتین مشخص هستند و کمی به سمت وسط است و هر کدام از آنها تقسیم میوز ɪ انجام می دهند و هر کدام دو سلول را بوجود می آورند که اسپرماتوسیت ثانویه گویند که میوز  ɪ ɪ را انجام می دهد و 4 سلول را تولید می کند که اسپرماتید گویند و دارای هسته ی کوچک است و دم ایجاد می کند و سیتوپلاسم را از دست می دهد و بعد اسپرم را بوجود می آورد.سلول های Sertoli که اتصالات محکم را ایجاد می کند دارای هسته ی دوکی شکل و کشیده است و 30% بافت بیضه را به خود اختصاص داده است.

 

+ نوشته شده در  چهارشنبه بیست و هشتم اردیبهشت 1390ساعت 10:44  توسط SAJJAD.R  |